Kromatografi

Post pintar kedua membahas tentang…. Kromatografi. Yap, ada yang udah tahu? Sebenarnya ini materi udah lama banget di simpen di kepala, sampe-sampe hampir nguap. Maklum, materi-materi pelajaran emang sifatnya lebih volatil, hihi. Kita belajar sama-sama ya, kalo ada yang luput dari bahasan, punten tolong di tambahin lewat kolom komen.

 

Definisi

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan suatu komponen dari campurannya. Pemisahan tersebut berdasarkan laju migrasi dari masing-masing komponen, yang dikarenakan adanya perbedaan koefisien distribusi atau partisi masing-masing komponen diantara dua fase (Fase diam dan fase gerak). Hasil pemisahan kromatografi yang baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuk tunggal.

 

Fase diam dan Fase gerak

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak merupakan pembawa analit, dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini nggak melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).

Pemisahan dengan Kromatografi

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram. Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektor. Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam maka semakin lama pula analit tersebut keluar, sehingga menyebabkan waktu retensinya (tR) semakin besar. Contoh gampangnya gini, kita ibaratkan A dan B sebagai analit. Si A ini gemar sekali berbelanja, sedangkan si B tidak. Jika suatu hari A dan B melewati pasar yang penuh dengan toko-toko baju, maka bisa dibayangkan apa yang terjadi? Si A akan memiliki waktu retensi lebih banyak karena setiap toko ia kunjungi, berbeda dengan si B yang adem-ayem terus berjalan. Pada pintu keluar pasar nanti, si B akan lebih dulu sampai dibandingkan si A yang masih tertambat disana-sini. Dengan begitu kita bisa memisahkan si A dan si B, hehe. Semoga nggak tambah bingung dengan penjelasan ini :p

Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi, karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu juga permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar.

Macam-macam kromatografi

Teknik pemisahan menggunakan metode kromatografi terdiri dari beberapa macam, berikut ini disajikan beberapa macam teknik kromatografi beserta penjelasannya:

1. Kromatografi kertas

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Kromatografi kertas menggunakan fase diam kertas, yakni kandungan selulosa di dalamnya, sedangkan untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah, selanjutnya sampel dan pelarut berdasarkan gaya kapilaritas akan terserap dan bergerak ke atas. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.

Perbandingan jarak relatif antara senyawa (sampel) dengan jarak pelarut dihitung sebagai nilai Rf.

Rf = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil).

Aplikasi penggunaan dari kromatografi kertas sendiri adalah untuk memisahkan diantaranya adalah tinta, zat pewarna, senyawa tumbuhan seperti klorofil , make up dan berbagai zat lainnya.

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai Rf, masing-masing asam amino diidentifikasi.

Contoh hasil kromatografi kertas pigmen

 

2.      Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan sebuah lempengan tipis yang terbalut gel silika atau alumina. Silika atau alumina tersebut berfungsi sebagai fase diam. Materi lain juga bisa digunakan sebagai fase diam asalkan mampu mengalami pendarflour (fluorescence) dalam sinar ultra violet. Sementara untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang digunakan. Aplikasi dari teknik pemisahan kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mengetahui jenis pada campuran asam amino tertentu. Teman-teman mungkin bertanya, interaksi apa yang terjadi pada proses kromatografi cair sehingga terjadi pergerakan sampel di dalam pelarut? Ada beberapa interaksi yang terjadi, diantaranya adalah pembentukan ikatan hidrogen, ikatan vander walls dan gaya debye. Atau bisa juga berupa pembentukan senyawa kompleks.

3.      Kromatografi partisi

Dasar pemisahan kromatografi partisi adalah konsep like dissolves like, yaitu dimana senyawa polar menyukai polar, dan sebaliknya senyawa nonpolar menyukai nonpolar. Atau kata gaulnya: Penyuka sesama jenis, hihihi. Sesuai prinsip like dissolves like, senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam maka akan tertambat lebih lama pada fase diam, sehingga mengakibatkan tR lebih besar.

 

Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik. Alat utama yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 5cm-1m. pada bagian dasar tabung diberi semacam penyaring dari glass wool untuk menghindari hilangnya fasa diam. Fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah suatu adsorben padat. Biasanya berupa silica gel atau alumina. Dahulu juga sering digunakan bubuk selulosa. Fasa diam berbentuk serbuk microporous untuk meningkatkan luas permukaan. Sedangkan fasa gerak atau eluen adalah campuran cairan murni. Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Terdapat dua metode pada kromatografi kolom, yaitu metode kering dan metode basah. Pada metode kering, kolom diisi dengan fasa diam kering, diikuti dengan penambahan fasa gerak yang disiramkan pada kolom sampai benar-benar basah. Sedangkan pada metode basah, bubur (slurry) disiapkan dengan mencampurkan eluen pada serbuk fasa diam dan dimasukkan secara berhati-hati pada kolom. Eluen kemudian dituangkan pelan-pelan melewati kolom.

 

Cara kerja kromatografi kolom yaitu, komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adsorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi. Seluruh proses kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar berikut ini:

4.      Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).

Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

 

5.      HPLC

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.

Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.

Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.

 

6.      Ion-exchange chromatography

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawa yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.

 

Mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion. Berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:

·      Penukar anion

Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diam

·      Penukar kation

Fase diamnya muatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

 

7.      Exclusion chromatography

Dalam teknik ini, gel non ionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM). Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography.

 

Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan high performance liquid chromatography (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT).

 

Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu. Jadi nanti saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. Sedangkan molekul yang besar tidak bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi. Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil).